Projekt dofinansowano ze środków Budżetu Państwa od Narodowego Centrum Badań i Rozwoju w ramach programu międzynarodowego i konkursu: ERA-NET NEURON, Transnational Research Projects on Neurodevelopmental Disorder, na podstawie umowy nr NeuronC2/I/23/RestoreLeak/2023 z dnia 28.04.2023 r.
Tytuł projektu: „”RestoreLeak” – przyspieszenie badań nad kanałopatiami neurorozwojowymi: z laboratorium do kliniki” / j. ang. „Accelerating Research on Neurodevelopmental Channelopathies: from Bench to Bedside”
Wartość całkowita projektu: 784 184,81 zł
Wartość dofinansowania dla WIM: 784 184,81 zł
Okres realizacji: 01.09.2022 r. – 31.05.2026 r.
Koordynator projektu: prof. dr n. med. Leszek Lisowski
Lider projektu: Wojskowy Instytut Medyczny – Państwowy Instytut Badawczy
Dziedzina: Neuronauki, genowe terapie celowane
Status projektu: zakończony
Projekt krajowy stanowi część projektu międzynarodowego realizowanego przez konsorcjum:
- CENTRUM NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE- „CNRS”, Paryż Francja;
- L’UNIVERSITE DE MONTPELLIER – „UM”, Montpellier, Francja;
- INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE – „INSERM”, Paryż Francja;
które działają w imieniu i na rzecz INSTITUT DE GÉNOMIQUE FONCTIONNELLE – CNRS UMR5203 -U1191, jako Lider konsorcjum;
- FUNDACJON DE LA COMUNIDAD VALENCIANA CENTRO DE INVESTIGACIÓN PRÍNCIPE FELIPE, Walencja, Hiszpania;
- UNIWERSYTET MIGUELA HERNANDEZA, Elche, Alicante, Hiszpania;
- UNIWERSYTET KOPENHASKI, Kopenhaga, Dania;
- FUNDACIÓN INICIATIVA PARA LAS NEUROCIENCIAS, Madryt, Hiszpania;
- Wojskowy Instytut Medyczny – Państwowy Instytut Badawczy, Warszawa, Polska;
Głównym celem projektu międzynarodowego jest rozszyfrowanie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w etiologię dwóch ultra rzadkich i poważnych zaburzeń rozwojowych człowieka powiązanych z mutacjami w genie NALCN oraz opracowanie innowacyjnych strategii leczenia pacjentów. Projekt ten obejmuje połączenie specyficznej i uzupełniającej się wiedzy oraz doświadczenia z różnych laboratoriów, a także wykorzystanie oryginalnych modeli komórkowych i zwierzęcych, jak również współpracę z klinicystami i dostęp do pacjentów.
Link do strony projektu międzynarodowego:
PROJECT: JTC2021 – Neurodevelopmental Disorders: RestoreLeak – ERA-NET NEURON
W ramach zadania WIM-PIB celem projektu było opracowanie przedklinicznych narzędzi badawczych i terapeutycznych dla chorób neuro-rozwojowych związanych z mutacjami genu NALCN, tj. zespołów CLIFAHDD oraz IHPRF1. W trakcie realizacji projektu przeprowadzono charakterystykę pacjentów oraz analizę wybranych mutacji NALCN, co potwierdziło istotne zróżnicowanie mechanizmów będących podłożem choroby i wskazało na potrzebę opracowywania personalizowanych strategii terapeutycznych zależnych od rodzaju mutacji. Równolegle utworzono modele choroby oparte na komórkach mysich i ludzkich oraz opracowano platformę przesiewową do identyfikacji cząsteczek zdolnych do przywracania prawidłowej funkcji białka NALCN. W ramach tych badań wytypowano pierwszych kandydatów terapeutycznych oraz zidentyfikowano nowe szlaki biologiczne potencjalnie istotne dla przyszłych interwencji.
Zespół odpowiedzialny za zadanie 2 w WP3 opracował kluczowe narzędzia przedkliniczne dla terapii genowej NALCN. Ponieważ pełna sekwencja NALCN przekracza pojemność pojedynczego wektora AAV, opracowano rozwiązania oparte na odtworzeniu pełnowymiarowego mRNA z dwóch fragmentów transgenu. Spośród kilku testowanych wariantów wyłoniono strategię wykorzystującą rybozym typu hammerhead, która umożliwiła skuteczne ponowne złożenie pełnowymiarowego mRNA NALCN i translację do funkcjonalnego białka w komórkach ludzkich. Dwa konstrukty kodujące odpowiednio N- i C-końcową część białka zostały umieszczone w wektorach AAV i są obecnie wykorzystywane do badań funkcjonalnych przez konsorcjantów. Istotnym elementem projektu było również opracowanie modeli komórkowych specyficznych dla pacjentów. W związku z brakiem możliwości pozyskania materiału biologicznego od pacjentki z częstą mutacją p.I322T, podjęto próbę wprowadzenia tej mutacji do wcześniej scharakteryzowanych linii iPSC metodami HDR oraz HITI z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9. Pomimo licznych prób nie uzyskano żywotnych klonów z mutacją p.I322T, co może wskazywać na niską podatność locus NALCN na edycję lub potencjalnie szkodliwy wpływ tej mutacji na komórki. Po konsultacjach w Konsorcjum strategię zmodyfikowano, wprowadzając do komórek iPSC inne patogenne warianty: p.E280D, p.K1115N oraz p.V316M. W przypadku tych mutacji uzyskano odpowiednie linie komórkowe, które są obecnie namnażane i poddawane końcowej charakterystyce.
Dodatkowo przeprowadzono funkcjonalną ocenę 86 wariantów AAV pod kątem transdukcji komórek iPSC oraz neuronów różnicowanych z iPSC. Jako najbardziej efektywny wskazano wariant AAV-7m8. Uzyskane rezultaty tworzą kompleksową platformę do dalszej walidacji terapii genowej NALCN*i stanowią podstawę dla rozwoju przyszłych interwencji przyczynowych w tej grupie ultrarzadkich chorób. Wyniki projektu będą rozpowszechniane poprzez publikacje w czasopismach naukowych o wysokim współczynniku wpływu z otwartym dostępem, a także za pośrednictwem Fundacji Libellas, organizacji non-profit wspierającej pacjentów, której celem jest poprawa jakości życia dzieci dotkniętych chorobami objętymi projektem. W ramach projektu został opracowany i zweryfikowany system oparty na dwóch wektorach AAV stanowiący podstawę dla przyszłych terapii genowych. Posiada on potencjał w zakresie własności intelektualnej oraz wartość komercyjną. Uzyskane konstrukty i zgromadzone dane zostaną wykorzystane do napisania nowych projektów badawczych.
Publikacje:
- Candela Barettino; Jorge Maldonado-Torres; Yillcer Molina; Álvaro Ballesteros-González; Mario Soriano; Alexandra Typou; Leszek Lisowski; Stephan Alexandre Pless; Antonio Gil-Nagel; Arnaud Monteil; Ramon Reig; Isabel Del Pino „NALCN shapes hippocampal function through GABAergic interneuron control” manuscript under reiview in Science Advances. PUBLIKACJA W PROCESIE RECENZJI. Publikacja będzie dostępna w trybie open access co przyczyni się do szerszego rozpowszechniania wyników badań zgodnie z polityka otwartego dostepu. W publikacji zamieszczono informacje o tym, że realizacja projektu została sfinansowana przez NCBR.
Wystąpienia konferencyjne:
- W dniach 16-17 maja 2024 r. w Berlinie odbyło się spotkanie ERA-Net NEURON Midterm symposium, w czasie którego reprezentanci konsorcjum prezentowali postępy projektu. Wystąpienie zawierało informację o tym, że realizacja projektu została sfinansowana przez NCBR
- Udział w konferencji 1st NALCN workshopr The sodium Leak Channel in health and disease. 1-2.09.2023. miejsce: Hiszpania/Alicante. Osoba wygłaszająca referat związany z projektem: dr n. med. Leszek Lisowski. Wydarzenie zorganizowane w ramach projektu konsorcjum ERA-NET NEURON RestorLeak. Wystąpienie zawierało informację o tym, że realizacja projektu została sfinansowana przez NCBR